Considerazioni in merito alla presunta attività biocida in campo del fertilizzante Dentamet.

Enrico Bucci – Professore Aggiunto – Temple University (USA)
Roberto Defez – Primo Ricercatore Istituto di Bioscienze e Biorisorse – C.N.R.
Donatello Sandroni – Dottore di ricerca in Ecotossicologia

Recentemente è stata depositata la relazione conclusiva di uno studio per testare l’attività del fertilizzante Dentamet nel contenimento di Xylella fastidiosa in olivo. Tale relazione, in verità consistente in tre scarne paginette, fa riferimento per quanto riguardo l’attività in campo del composto all’unico lavoro in cui siano state effettuate misure, ovvero il seguente:

Scortichini M, Chen J, De Caroli M, et al. A zinc, copper and citric acid biocomplex shows promise for control of Xylella fastidiosa subsp. pauca in olive trees in Apulia region (southern Italy). Phytopathol Mediterr. 2018;57(1):48-72

A prescindere dai numerosi dubbi che questo lavoro pone, già ampiamente discussi altrove, vorremmo questa volta focalizzarci su una singola, semplice domanda: esiste, sulla base dell’unico lavoro pubblicato che contiene dati utili a rispondere, la prova scientifica diretta che il Dentamet sia in grado di diminuire la carica batterica di olivi infetti da Xylella fastidiosa?

In letteratura, esistono già due lavori che prendono in considerazione la questione. In particolare, in una sua recente revisione dei possibili rimedi per fronteggiare l’infezione da Xylella in olivo[1], EFSA scrive quanto segue proprio riferendosi all’articolo in questione:

“the results did not demonstrate that Dentamet® provided a full control of the disease over the 3 years of the experiment. Some of the results of this study are based on a limited sample size and additional data are thus needed to verify the effectiveness of this disease control measure.”

A maggio 2019, dunque, si scrive che i dati ottenuti per il Dentamet sono basati su un campione troppo piccolo per dire alcunché – un concetto su cui ritorneremo più avanti.

La cosa è ribadita in un’altra pubblicazione peer-reviewed[2], di impact factor pure superiore rispetto a quella in questione, ove i revisori anonimi hanno concordato con uno di noi (EB) nel ritenere che:

“While some beneficial effects in vitro were reported for all the aforementioned compounds, in planta data are always obtained from samples too small to draw statistically meaningful conclusions. A similar, serious limitation affects a recent report on in planta efficacy of a commercial copper-zinc fertilizer, which was sprayed over infected olive trees in Italian orchards. The reported antibacterial activity was based on the analysis of 4 olive trees (of which 1 had died during the study). “

Peraltro, l’analisi dettagliata dei dati riportati nel lavoro costringe comunque a giungere ad una risposta negativa alla domanda iniziale.

In primo luogo, infatti, come descritto nel lavoro in questione, la misura cruciale, quella della concentrazione batterica in albero dopo il trattamento in paragone ad ulivi non trattati, è stata effettuata in due piante trattate e due di controllo (con una pianta persa durante lo studio). Con un campione sperimentale così piccolo, non vi è nessuna possibilità di fare affermazioni di significato generale, perché non vi è rappresentatività statistica sufficiente. Perché il lettore meno avvezzo alla statistica comprenda meglio: trarre indicazioni circa la capacità del Dentamet di inibire il batterio in campo studiando 4 olivi, equivarrebbe a pretendere di indovinare il risultato delle prossime elezioni politiche interrogando quattro persone.

In secondo luogo, la proclamata differenza tra trattati e non trattati, che gli autori pretendono di attribuire al Dentamet, è spiegabile con il fatto che si presentano i dati scegliendo due piante di controllo che contenevano in partenza (dalla prima misura) molto più batterio rispetto a quelle usate per testare il trattamento (figura 7 del lavoro, misure di partenza tra giugno e luglio 2016). La riprova del fatto che le differenze tra trattati e non trattati descritta nel lavoro sia dovuta alla scelta iniziale, e non al trattamento, la si ha a seguito della gelata di gennaio 2017: nella figura 7, infatti, si nota come le piante trattate diventino indistinguibili dall’unica pianta di controllo residua. In particolare, nel 2017 la differenza media tra Ogliarola trattata e Cellina di controllo, così come quella tra Cellina trattata e Cellina di Controllo, non è significativa (Welch’s T-Test, p=0.25 e p= 0.34 rispettivamente, si veda figura seguente; Dent= Dentamet, Cont = controllo).

Quindi, se ne può dedurre ragionevolmente che se gli alberi fossero stati scelti in partenza in modo tale da avere tutti grosso modo la stessa carica batterica, come vorrebbero le regole di buona pratica sperimentale e come avviene in ogni caso a causa della gelata del 2017, ogni differenza statistica tra trattati e controlli scomparirebbe.

Volendo comunque considerare tutti i dati – anche quelli del 2016 – si può cercare di rimediare alla cattiva scelta dei controlli rinormalizzando per ogni albero le misure nel tempo rispetto al corrispondente valore iniziale.

Si ottiene così il grafico seguente (Dent = dentamet, Cont = controllo).

Come è immediato rilevare, l’effetto di diminuzione del DNA batterico è addirittura più pronunciato nei controlli che nei trattati. La diminuzione spontanea del DNA batterico anche nei controlli potrebbe essere sia una fluttuazione casuale, sia un effetto del freddo (gelate del 2017), sia – e avrebbe forse più senso – il semplice effetto del graduale disseccamento degli alberi, che se esteso porta a morte la pianta ma anche alla scomparsa del batterio; non lo sapremo in ogni caso mai interrogando un campione così piccolo come quello studiato.

Per quanto sopra riportato, se non fosse per il fatto che il campione di ulivi studiato è troppo piccolo per trarre conclusioni, i dati pubblicati nel lavoro, una volta correttamente normalizzati, porterebbero matematicamente a dire che il Dentamet è inefficace o paradossalmente peggiorativo; del resto questi sono gli artefatti che si osservano in studi mal disegnati su campioni senza potere statistico.

In terzo luogo, i dati contenuti nel lavoro, una volta normalizzati come abbiamo visto, dimostrano che la variabilità nel tempo della concentrazione del batterio in pianta è maggiore o uguale alla variabilità osservata tra piante trattate e non trattate. Questo significa che le variazioni osservate paragonando in un dato istante di tempo ulivi trattati e non trattati non sono significativamente diverse dalle variazioni casuali della concentrazione del batterio in una singola pianta. Di seguito la seguente tabella di dati rinormalizzati (Dent = Dentamet; Cont = controllo):

A questo punto, applicando un test T accoppiato, si può osservare come le variazioni percentuali medie di concentrazione del batterio nei trattati e nei controlli non siano statisticamente significative; all’interno di una data pianta, cioè, il batterio aumenta o diminuisce tra una misura e la successiva in misura non diversa dalle differenze osservate tra trattati e controlli, a significare che le fluttuazioni di concentrazione batterica dovute a fattori diversi dal Dentamet sono maggiori o uguali a quell’effetto che si vorrebbe rivelare.

In quarto luogo, il metodo utilizzato dai ricercatori per quantificare le cellule batteriche imporrebbe una certa cautela nel trarre delle conclusioni “definitive” sulla popolazione di batterio “vitale” diagnosticata all’interno delle piante. Il test basato sulla qPCR identifica indiscriminatamente cellule vive e cellule morte. L’effetto “biocida” del Dentamet sul batterio nelle piante trattate doveva essere valutato con la verifica dell’assenza o della minore concentrazione di cellule “vive” attraverso isolamento in coltura o altre tecniche. Nessun test viene effettuato per validare quanto affermato sulla base degli esiti del saggio qPCR: meno batterio nei tessuti trattati dovrebbe corrispondere a una maggiore difficoltà dello stesso a colonizzazione nuovi tessuti, cioè ci si aspetterebbe che nelle piante trattate ci sia maggiore erraticità del batterio, soprattutto nelle nuove porzioni vegetanti. Peraltro, nonostante gli autori riportano la raccolta di ben 12 campioni per pianta, non vi è poi alcun riferimento a riguardo del numero di campioni/pianta risultati positivi, probabilmente è sottointeso che tutti i campioni fossero positivi? E che nessuna differenza in termini di distribuzione del batterio sia stata riscontrata tra piante trattate e non trattate?

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[1] Bragard C, Dehnen-Schmutz K, Di Serio F, et al. Effectiveness of in planta control measures for Xylella fastidiosa. EFSA J. 2019;17(5). doi:10.2903/j.efsa.2019.5666

[2] Bucci EM. Xylella fastidiosa, a new plant pathogen that threatens global farming: Ecology, molecular biology, search for remedies. Biochem Biophys Res Commun. 2018;502(2):173-182. doi:10.1016/j.bbrc.2018.05.073